摘要：

　　線粒體和復(fù)雜的內(nèi)膜系統(tǒng)是真核細(xì)胞的重要特征。到目前為止，對(duì)活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器進(jìn)行操縱仍然十分困難。多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)能夠從活細(xì)胞中提取、注射細(xì)胞器，將定量的線粒體移植到細(xì)胞中，同時(shí)保持它們的活力。

　　近期，Julia A.Vorholt課題組使用多功能單細(xì)胞顯微操作FluidFM技術(shù)，將線粒體移植至培養(yǎng)的細(xì)胞中，并實(shí)時(shí)跟蹤線粒體注射后的情況，監(jiān)測(cè)它們?cè)谛滤拗骷?xì)胞中的命運(yùn)。通過跟蹤，作者發(fā)現(xiàn)與受體細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)融合發(fā)生在移植后20分鐘，持續(xù)16小時(shí)以上。活細(xì)胞之間移植線粒體不僅為細(xì)胞器生理學(xué)的研究開辟了新的前景，也為機(jī)械生物學(xué)、合成生物學(xué)和疾病治療開辟了新的前景。該篇文章以”Mitochondria transplantation between living cells.”為題，發(fā)表在BioRxiv.上。

　　結(jié)果：

　　1.從活細(xì)胞中提取線粒體

　　為了檢測(cè)FluidFM探針對(duì)單細(xì)胞細(xì)胞器采樣的能力。作者使用了兩種探針，分別是錐型探針(A=1.2 um2)和圓柱型探針(A=1.6 um2)(圖1B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用這兩種探針都可以對(duì)線粒體及單個(gè)線粒體進(jìn)行提取或大量抽提。

　　作者對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）和線粒體提取后的細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞仍保持較高的細(xì)胞活力(>95%)。為了進(jìn)一步確保FluidFM提取方案在探針插入時(shí)不會(huì)破壞細(xì)胞質(zhì)膜，作者使用熒光探針(mito-R-GECO1)監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基中可能發(fā)生的Ca2+內(nèi)流。實(shí)驗(yàn)顯示，在操作過程中和操作后都沒有Ca2+流入，表明細(xì)胞器提取過程中細(xì)胞質(zhì)膜的完整性。

　　本研究還發(fā)現(xiàn)暴露在FluidFM負(fù)壓下的線粒體小體會(huì)經(jīng)歷形狀的轉(zhuǎn)變，類似于“串上珍珠”的形態(tài)。其特征是離散的線粒體基質(zhì)球體狀，并且通過細(xì)長的膜結(jié)構(gòu)相互連接，在進(jìn)一步負(fù)壓拉力的作用下，這些球狀結(jié)構(gòu)最終被拉斷，并在懸臂中呈現(xiàn)為球狀線粒體(圖2E)。進(jìn)一步探究顯示，施加FluidFM負(fù)壓后，力誘導(dǎo)的形狀轉(zhuǎn)變沿線粒體小管在毫秒到秒的范圍內(nèi)傳播了數(shù)十微米。形狀轉(zhuǎn)變沿這一方向均勻傳播，而外層線粒體膜(OMM)保持了最初的完整性。當(dāng)牽引力保持?jǐn)?shù)秒后，OMM在先前形成的“珍珠”之間的一個(gè)或多個(gè)收縮點(diǎn)分離，從而產(chǎn)生獨(dú)立的球形線粒體，而管狀結(jié)構(gòu)的其余部分放松并恢復(fù)。結(jié)合線粒體牽引實(shí)驗(yàn)和線粒體定位的鈣流實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明線粒體的串上珍珠表型的形狀轉(zhuǎn)變以及隨后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體裂變是不依賴鈣的。

　　圖1：(A)示意圖：使用FluidFM技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞器提取。通過調(diào)整懸臂探針中的負(fù)壓(-Δp)進(jìn)行提取。(B)通過調(diào)節(jié)孔徑大小和流體作用力的適用范圍，選擇性地提取不同的細(xì)胞器成分。第1行：用懸梁臂探針提取單細(xì)胞細(xì)胞器的示意圖。第2行：不同孔徑的懸臂尖掃描電鏡圖。第3行：FluidFM懸臂探針孔徑與對(duì)應(yīng)的流體力范圍。(C)示意圖：使用FluidFM技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞器注射。通過調(diào)整懸臂探針中的正壓(+Δp)進(jìn)行將探針中的細(xì)胞器注射到受體細(xì)胞內(nèi)。

　　圖2：(A)FluidFM懸臂探針的掃描電子顯微鏡圖像。具體尺寸參數(shù)是：L=200μm,W=35μm,H=1μm。Scale bar=5μm。(B)提取線粒體后的FluidFM懸臂的熒光顯微鏡圖像。由于折射率不同，可以看到提取物和懸臂探針填充物之間的邊界。Scale bar=10μm。(C)是圖(B)的示意圖，提取物的體積是1170 fL。(D-F)活細(xì)胞器提取的延時(shí)圖像和提取后金字塔懸臂圖像。黃框表示細(xì)胞內(nèi)的懸臂尖的位置。(D)對(duì)表達(dá)su9-BFP(線粒體)和Sec61-GFP(ER)的U2OS細(xì)胞進(jìn)行提取。箭頭表示ER區(qū)域。使用孔徑為0.5μm2的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。(E)從表達(dá)su9-BFP的U2OS細(xì)胞中提取單個(gè)線粒體。使用1μm2孔徑的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。(F)從表達(dá)su9-BFP的U2OS細(xì)胞中提取數(shù)個(gè)線粒體。使用1μm2孔徑的懸臂梁探針。Scale bar=10μm。

　　2.線粒體移植至新細(xì)胞

　　研究人員的下一個(gè)目標(biāo)是將線粒體移植到新的宿主細(xì)胞中，并保持細(xì)胞活性。FluidFM技術(shù)為線粒體轉(zhuǎn)移提供了兩種可能性方案：方案一、用FluidFM技術(shù)直接提取線粒體而后注入到新的宿主細(xì)胞中；方案二、將從細(xì)胞中分離純化的線粒體回充入FluidFM探針，然后注射(圖3A-D)。作者比較了兩種方法，為了實(shí)現(xiàn)可視化的線粒體的轉(zhuǎn)移，作者在供體和受體細(xì)胞中分別對(duì)線粒體進(jìn)行了差異化標(biāo)記(圖3E-F;供體細(xì)胞線粒體su9-mCherry和受體細(xì)胞線粒體su9-BFP)。當(dāng)使用FluidFM直接將線粒體從一個(gè)細(xì)胞移植到另一個(gè)細(xì)胞時(shí)，成功率高達(dá)95%，而且保持了細(xì)胞活力(圖3G,41個(gè)移植細(xì)胞中有39個(gè))。在注射純化線粒體后，作者觀察到46%的樣本(19/41)發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)移且保持了細(xì)胞活力(圖3G)。移植的定量結(jié)果顯示，這些實(shí)驗(yàn)中移植的線粒體數(shù)量從3到15個(gè)線粒體每個(gè)細(xì)胞不等(圖3H)。兩種替代方案的不同成功率可以由線粒體分離獲取的條件差異來解釋。在評(píng)估線粒體提取方案時(shí)，作者觀察到部分提取的線粒體外膜發(fā)生破裂。線粒體的不可逆損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)降解，細(xì)胞色素C釋放可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

　　雖然線粒體的細(xì)胞間移植降低了通量，但它的優(yōu)點(diǎn)是細(xì)胞外時(shí)間短(<1分鐘)，并且通過FluidFM采樣的線粒體大限度地集中在原生細(xì)胞質(zhì)液中，完全避免了人工緩沖液的使用。在提取和移植之前，作者通過在探針中填充不混溶的C8F18來確保提取液在提取過程中保持在孔徑附近。因此，只有很小的體積(0.5-2pL)被注入到宿主細(xì)胞中(圖3B)。

　　除了標(biāo)記供體細(xì)胞的線粒體(su9-mCherry)外，還標(biāo)記了受體細(xì)胞的線粒體(su9-BFP)，這樣就能夠觀察移植細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)的實(shí)時(shí)狀態(tài)。在上述兩種移植方案(移植和純化后注射)中，宿主-線粒體網(wǎng)絡(luò)的管狀狀態(tài)不會(huì)因注射過程而產(chǎn)生影響。此外，標(biāo)記可以讓作者可視化地監(jiān)測(cè)線粒體地移植，觀察線粒體地融合。無論移植方法是細(xì)胞到細(xì)胞(圖3I)，還是注射純化線粒體(圖3J)，都可以觀察到這些過程。實(shí)驗(yàn)跟蹤了22個(gè)細(xì)胞的移植命運(yùn)：18個(gè)細(xì)胞顯示移植的線粒體完全融合，4個(gè)細(xì)胞的線粒體發(fā)生降解。多數(shù)細(xì)胞樣本(18個(gè)細(xì)胞中的14個(gè))在移植后30分鐘內(nèi)初次觀察到融合事件。

　　如上所述，細(xì)胞間移植即方案一的效率高，并可以直接觀察單個(gè)移植線粒體的命運(yùn)。為了展示這一點(diǎn)，作者將標(biāo)記好的線粒體(su9-mCherry)從HeLa細(xì)胞移植到差異標(biāo)記的U2OS細(xì)胞(su9-BFP)中，這種細(xì)胞通常用于研究動(dòng)態(tài)線粒體行為。高靈敏度相機(jī)可以用于追蹤受體細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)線粒體(圖3L)。作者觀察到熒光線粒體基質(zhì)標(biāo)簽在移植后23分鐘的發(fā)生初始融合而后擴(kuò)展到線粒體網(wǎng)絡(luò)。

　　綜上所述，作者建立了兩種將線粒體轉(zhuǎn)移到單個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的方法。一種方法是活細(xì)胞間移植。該方案顯示移植后細(xì)胞活力高，允許觀察移植后線粒體的動(dòng)態(tài)行為，是一種高效方案。第二種方法是大量純化線粒體并將其注射到受體細(xì)胞中。注射速度相當(dāng)快，但不可避免地?fù)p害線粒體和細(xì)胞功能。

　　圖3：(A)方案一示意圖（活細(xì)胞間線粒體移植）：通過FluidFM吸入法提取線粒體。隨后，將帶有提取物的懸臂探針移至受體細(xì)胞插入并注入提取物。(B)方案一預(yù)填充C8F18的FluidFM懸臂梁的圖像，被移植線粒體通過su9-mCherry標(biāo)記，提取量~0.8 pL。Scale bar=10μm。(C)方案二示意圖（純化線粒體注入細(xì)胞）：使用標(biāo)準(zhǔn)線粒體純化方案純化的線粒體進(jìn)行線粒體移植的方案。將純化的線粒體重懸在HEPES-2緩沖液中，直接填充到FluidFM探針中并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行注射。(D)方案二由su9-mCherry標(biāo)記的FluidFM懸臂充滿線粒體的圖像。Scale bar=10μm。(E)通過方案一（活細(xì)胞間線粒體移植）進(jìn)行線粒體移植后的宿主細(xì)胞圖像。宿主細(xì)胞的線粒體通過su9-BFP標(biāo)記，移植細(xì)胞線粒體通過su9-mCherry標(biāo)記。Scale bar=10μm。

　　(F)通過方案二（純化線粒體注入細(xì)胞）進(jìn)行線粒體移植后的受體細(xì)胞圖像。宿主細(xì)胞的線粒體通過su9-BFP標(biāo)記，移植細(xì)胞線粒體通過su9-mCherry標(biāo)記。Scale bar=10μm。(G)通過光學(xué)成像對(duì)兩種方案注射的細(xì)胞進(jìn)行評(píng)估。每種方法評(píng)估了40個(gè)細(xì)胞。(H)兩種方案的線粒體的絕對(duì)計(jì)數(shù)評(píng)估。每種方法評(píng)估了22個(gè)細(xì)胞。(I)方案一移植線粒體后，對(duì)移植線粒體(su9-mCherry)和宿主線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)使用不同的熒光標(biāo)記進(jìn)行成像，融合。Scale bar=5μm。(J)方案二注入純化線粒體后移的融合狀態(tài)，標(biāo)記方案同(I)。Scale bar=5μm。(K)移植線粒體發(fā)生降解，分裂成多個(gè)更小的熒光囊泡(su9-mCherry)，熒光與標(biāo)記的宿主細(xì)胞線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)沒有重疊。Scale bar=5μm。(L)單個(gè)移植線粒體的延時(shí)圖像序列(su9-mCherry)。細(xì)胞器供體為HeLa細(xì)胞，受體細(xì)胞為U2OS細(xì)胞，帶有熒光標(biāo)記線粒體網(wǎng)絡(luò)(su9-BFP)。Scale bar=10μm。

　　討論

　　單細(xì)胞的操縱一直是細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，尤其是在不損害細(xì)胞活力的情況下從細(xì)胞中提取細(xì)胞器或?qū)⑼庠次镔|(zhì)直接導(dǎo)入到細(xì)胞中。截止到目前，盡管單細(xì)胞技術(shù)有了較大的發(fā)展，但要實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞器從一個(gè)細(xì)胞移植到另一個(gè)細(xì)胞，除了更大的卵母細(xì)胞外，幾乎是不可能實(shí)現(xiàn)的。

　　線粒體是細(xì)胞中的能量轉(zhuǎn)換的核心，與細(xì)胞代謝和信號(hào)通路以及細(xì)胞命運(yùn)緊密聯(lián)系在一起。線粒體含有自身的遺傳成分(mtDNA)，通常是嚴(yán)格垂直遺傳給子細(xì)胞的。目前將線粒體準(zhǔn)確地轉(zhuǎn)移到細(xì)胞的手段有限，對(duì)于線粒體移植后的劑量-反應(yīng)關(guān)系分析更是十分困難，這樣我們就很難從機(jī)制上了解健康或疾病細(xì)胞的線粒體移植后的生物學(xué)效應(yīng)。

　　本文使用的FluidFM技術(shù)采用微型探針，可以在微環(huán)境中以高時(shí)空分辨率操縱單細(xì)胞或者對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行采樣，并與組學(xué)方法相結(jié)合，使細(xì)胞器的研究成為可能。FluidFM技術(shù)將原子力顯微鏡的高精度力學(xué)調(diào)節(jié)手段與光學(xué)檢測(cè)下的納米尺度微流控系統(tǒng)相結(jié)合，提供與單細(xì)胞操作相關(guān)的力學(xué)和定量的體積控制。這些特性在現(xiàn)有微型探針中是的，在本研究中，作者將FluidFM單細(xì)胞技術(shù)用于活細(xì)胞真核內(nèi)和細(xì)胞間的細(xì)胞器微操作。成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞之間的線粒體移植。

　　該研究將啟發(fā)人們將FluidFM技術(shù)應(yīng)用于更多領(lǐng)域，例如，干細(xì)胞治療中低代謝活性細(xì)胞的再生，作為線粒體替代治療方法的一種備選方案等。此外，F(xiàn)luidFM技術(shù)為解決細(xì)胞生物學(xué)、生物力學(xué)和細(xì)胞工程等問題提供了新的視角。

　　多功能單細(xì)胞顯微操作系統(tǒng)-FluidFM OMNIUM

　　參考文獻(xiàn)

　　[1].C.G?belein,Q.Feng,E.Sarajlic,T.Zambelli,O.Guillaume-Gentil,B.Kornmann&J.Vorholt.Mitochondria transplantation between living cells.(2021).BioRxiv.